Metoder for å studere biofilm

Utviklingen av nye metoder for å studere biofilm har vært viktig for den eksponentielle økningen av faglige publikasjoner på biofilm de siste årene. Nedenfor beskriver vi ulike teknikker for å studere biofilm som benyttes ved Nofima.

Kontaktperson
Portrettbilde av Trond Møretrø
Trond Møretrø

Forsker
Tlf.: +47 64 97 02 16
trond.moretro@nofima.no

Disse forsøksmetodene består hovedsakelig av å standardisere dyrkning av biofilm, samt metoder for karakterisering, kvantifisering og visualisering av biofilm.

Dyrkningssystemer for biofilm kan deles i statiske og dynamiske systemer. Statiske systemer er modeller for biofilmdannelse under forhold uten væskestrøm over overflaten. Biofilmen er derfor ikke utsatt for skjærkrefter og det er heller ikke kontinuerlig tilførsel av ny næring. Eksempler på denne type biofilmer vil man kunne finne på flater som ofte er utsatt for kondens, i dødsoner/hulrom i prosessutstyr hvor det samler seg opp næringsstoffer eller i sprekker i slitte transportbånd. For dynamiske dyrkningssystemer dannes biofilmen under en væskestrøm. Biofilmen blir altså utsatt for skjærkrefter og man velger ofte også å ha en kontinuerlig tilførsel av næring. Eksempler på denne type biofilmer vil man kunne finne i rørsystemer (vannrør, melkeanlegg), i områder der det drypper væske nedover en flate. Ofte dannes biofilmer under vekslende betingelser. I for eksempel sluk vil det dannes biofilmer som i perioder utsettes for dynamiske forhold og i perioder har statiske betingelser. Valg av modellsystem for studering av biofilm er avhengig av hva slags type biofilm man ønsker å simulere. I og med at ulike bakterier krever ulike betingelser for å danne biofilm vil valg av system har stor betydning for om det dannes biofilm, hvor mye som dannes, biofilmens struktur, sammensetning og egenskaper.

Statiske systemer
I slike systemer vil materialet man dyrker biofilmen på være helt eller delvis dekket av et vekstmedium eller den dyrkes under svært høy luftfuktighet. Det mest vanlige systemet er å dyrke biofilmer i mikrotiterbrett av plast med 96 brønner, men bruk av kuponger som senkes ned i en suspensjon av mikroorganismer er også mye brukt. En tredje metode er å oppbevare kuponger tilsatt næring og mikroorganismer under høy luftfuktighet.

Dynamiske systemer
Disse systemene består vanligvis av et sterilt kammer, hvor vekstmedium tilføres kontinuerlig ved hjelp av en pumpe. Fordelen med slike systemer er at frittlevende celler vil fjernes, samt at det skjer en kontinuerlig tilførsel av næringsstoffer og fjerning av avfallsstoffer.

Bruk av flow-cell reaktorer med 3 uavhengige kanaler, der man kan studere 3 biofilmer samtidig, er et av de vanligste systemene for å studere biofilmer. I dette systemet kan man en kontinuerlig værskestrøm over biofilmen gjennom å pumpe væske gjennom et kammer. Dette systemet er spesielt tilpasset for å følge veksten av bakterier som utrykker GFP (Green Fluorescence Protein), da bakteriens dynamiske vekst over tid kan følges ved hjelp av et konfokal mikroskop.

CDC-reaktoren består av en sylinder der det settes ned 8 vertikale staker som igjen inneholder tre kuponger hver. Ofte har man en kontinuerlig tilførsel av ny næring ved å koble reaktoren til et pumpesystem. Reaktoren har et midtstilt røresystem og skjærkreftene oppnås ved å ha kontinuerlig røring av væsken. Stakene kan tas ut individuelt for å studere biofilm.

Et tredje dynamisk vekstsystem vi bruker er ”drip-flow” reaktoren. I Drip-flow systemet dyrkes biofilmen i et sterilt kammer som tilføres vekstmedium kontinuerlig med dråpevis tilførsel av ferskt vekstmedium.

Forskjellen mellom de to systemene er dråpevis tilførsel av ferskt vekstmedium i drip-flow systemet samt at overflaten er eksponert for luft, mens i flow cell systemet skjer tilførselen av medium kontinuerlig med større skjærkrefter. I drip-flow systemet kan biofilmen dyrket på en hvilken som helst type overflate mens i flow cell systemet, kan biofilmen bare dyrkes på dekkglass. En av de største fordeler med drip-flow systemet, er at man kan studere biofilm i åpne systemer i overgangen mellom væske og luft.

Målemetoder for biofilm
Antall mikroorganismer kan bestemmes ved å løsne dem fra materialet for eksempel med svabring eller ultralyd og ordinære mikrobiologiske metoder. Det er også vanlig å kvantifisere ved å måle total masse eller totalprotein eller -polysakkarid. Kvantifisering av biofilm kan også gjøres ved å farge biofilmen med fluoriscerende fargestoffer og spektroskopiske målinger.

En biofilm har en tredimensjonal struktur som ikke kan studeres med bare vanlig mikroskop. I det siste, har bruket av konfokal mikroskopi blitt et vesentlig verktøy for å analysere biofilm, som muliggjør en tredimensjonal studie uten å øddelege biofilmens struktur. Ulike fargeteknikker eller markører kan også brukes til å skille mikroorganismer av ulike stammer, eller fysiologiske og metabolisk celletilstand. Ved hjelp av MATLAB baserte dataprogrammer som COMSTAT og PHLIP kan man blant annet beregne gjennomsnittlig biovolum og tykkelse av en biofilm.

 Trygg og holdbar mat  

Relatert innhold