Funksjonell genomforskning på fiskehelse

Funksjonell genomforskning på laks og andre marine oppdrettsarter har hatt betydelig framgang det siste tiåret og er nå i en fase hvor informasjonen fra sekvenseringsprosjektene må anvendes for å løse de praktiske problemene vi står overfor i næringen.

Kontaktperson
Portrettbilde av Aleksei Krasnov
Aleksei Krasnov

Seniorforsker
Tlf.: +47 64 97 04 84
aleksei.krasnov@nofima.no

I Nofima Marin har en forskningsgruppe innen Fiskehelse og Marin Bioprospektering jobbet med mikromatriseteknologi (såkalt microarrays) for å analyse reguleringen av tusenvis av gener samtidig. De ønsker gjennom denne artikkelen å gi et innblikk i hvordan systematisk bruk av slik informasjon kan gi oss økt kunnskap om komplekse årsakssammenhenger som for eksempel sykdommer, men også hvordan profiler av genuttrykk kan brukes som markører og derved nye verktøy for sykdomspåvisning og generell diagnostikk av problemer relatert til fiskehelse.

Introduksjon

Sykdommer forårsaket av virus, bakterier og parasitter er en av de største risikofaktorene og kilde til tap i dagens fiskeoppdrett, og det brukes store ressurser på forskning og utvikling for forbedring av sykdomskontroll. Det er størst fokus på overvåkning av fiskehelse gjennom påvisning av agens, vaksinering, økt motstandskraft ved selektiv avl på sykdomsresistens, bruk av såkalte funksjonelle fórtilsetinger (ofte kalt ‘in-feeds’) samt generelle driftstiltak.

En av de største utfordringene ved helse- og sykdomsovervåkning er begrenset tilgjengelighet av diagnostiske verktøy stilet for ulike problemstillinger. Fiskehelse er mer enn bare sykdom, og vi har i dag få verktøy for å diagnostisere god eller dårlig helse på rutinebasis. Snakker vi om sykdomskontroll er dette mer enn bare påvisning av infeksiøst agens, og for enkelte sykdommer som for eksempel kardiomyopatisyndrom (CMS) kjenner vi ikke engang agenset som utløser sykdom. Problemer med å frambringe dødelighet med en del virussykdommer under eksperimentelle betingelser er et godt bevis på at infeksiøst agens ikke alene er tilstrekkelig, men at det er andre kausale faktorer som gir dødelighet i felt.

Budskapet må være at fiskehelse og sykdom er svært komplekse tilstander som fordrer analysemetoder med høy ‘throughput’ og oppløsning. I så måte knyttes det store forventninger til microarray metodikken som gir en bredspektret analyse av multiple genuttykk (tusenvis av gener) i en og samme prøve, og vi vil nedenfor belyse dette gjennom ulike eksempler fra vår forskning.

Når vi snakker om funksjonell genomforskning i dag, er det først og fremst microarray teknologien som er den vanligste metoden for å analysere genuttrykksprofiler. En microarray chip består av et objektglass hvor tusen- til titusenvis av biter av ulike gener er festet i form av PCR-amplifisert cDNA eller kortere oligonukleotider (oligoarray) i en bestemt orientering. Hvert punkt på chipen tilsvarer ett gen og blir brukt som en probe for å sammenligne uttrykket av genet i to prøver, altså et forholdstall mellom en test og kontrollfisk.

I en og samme prøve kan altså tusenvis av slike gener analyseres samtidig. Vi har utviklet vårt eget cDNA array kalt SFA2.0 bestående av 1800 gener i seks replikater som dekker alle de viktigste biokjemiske og cellulære responsene, og vi har i det senere også tatt i bruk oligoarrays med langt flere gener. Data blir generert med egen programvare og lagret i en egen database, og de viktigste resultatene fra microarray analyser blir rutinemessig verifisert med en uavhengig metode som real-time PCR. Denne plattformen har blitt anvendt i en rekke studier inkludert responser mot patogener, ulike stress-faktorer, ernæring, embryoutvikling og differensiering av celler.

Genuttrykk og diagnostikk av virussykdommer

Diagnostikk av infeksiøse sykdommer hos fisk baseres i dag utelukkende på påvisning av agens. Det er imidlertid mange indikasjoner på (og i teorien naturlig å forvente) at potensielt nye sykdommer eller agens eksisterer som vil kunne skape problemer inntil disse er karakterisert. I tillegg har vi også noen sykdommer med hittil ukjent agens som for eksempel CMS og HSMB, som ofte ikke kan diagnostiseres presist nok. Et annet problem er knyttet til asymptomatiske tilstander og infeksjoner der fisken kan være positiv for agens uten å nødvendigvis være syk. Disse problemene kan løses ved studier av interaksjonen mellom vert og patogen, ved å lete etter gener i verten som slås raskt og kraftig på som svar på infeksjonen og som er spesifikk, det vil si som skiller seg fra andre stresstilstander og ideelt sett også skiller mellom patogene og ikke-patogene stammer av viruset eller bakterien.

På den måten kan vi endre fokus mot å måle på vertsnivå, altså på fisken selv, i stedet for på agensnivå, og hvis denne responsen i tillegg kan måles i blod eller andre ikke-destruktive metoder, har vi et ideelt utgangspunkt for et diagnostisk verktøy.

Vi har hittil analysert laksens responser mot de viktigste virussykdommene; ILA, IPN og PD, samt de mer ukjente CMS og HSMB. Av dette har vi funnet et sett av gener, kalt virus-responsive gener (VRG), som oppreguleres kraftig mot virusinfeksjoner, men ikke mot andre stresstilstander som for eksempel bakterielle infeksjoner, inflammatoriske modeller (LPS-behandling), diett-relatert stress og kronisk stress. De fleste av disse genene har ukjente funksjoner og har lik respons mot virus i flere organer og i cellekultur. Forsøk med isolater av IPN virus med ulik virulens viser at VRG kan skille mellom dødelig og asymptomatisk infeksjon. Det er også interessant å merke seg at VRG viser samme uttrykksmønster i fisk infisert eksperimentelt med CMS og HSMB, som kan styrke hypotesen om at et virus er involvert i etiologien til disse uløste sykdommene.

For å utvikle en diagnostisk test har vi screenet rundt 100 kandidatgener med real-time PCR. Disse inkluderte VRG som finnes på mikromatrisen samt alle varianter (transkripter) av disse genene som finnes i sekvensdatabasene, siden mange er inkludert i multigen-familier og siden laksegener ofte finnes i mange kopier. Basert på dette har vi selektert åtte gener; ulike galectin-relaterte gener, et interferon-indusert gen og noen protein kinaser. Antistoffer mot disse vil nå bli testet i håp om å nærme oss en diagnostisk test som skal kunne anvendes i en rutinebasert overvåkning av virussykdommer. I videre studier vil vi også fokusere på sykdoms-spesifikke genprofiler som vil kunne være viktig for bedre differensiell diagnostikk.

Mekanismene bak resistens mot virus

Selv om mange generasjoner med selektiv avl har vist at det er stor individuell variasjon i sykdomsresistens hos laks, har vi i dag (kanskje med unntak av IPN) ingen stammer av helt resistent eller mer tolerant laks og derfor svært mangelfull kunnskap om hvilke mekanismer som styrer dette. Microarray analyse er et ideelt verktøy for å studere slike mekanismer fordi den potensielt gir et bredspektret bilde av alle cellulære responser i fisken (se graf).

Som et utgangspunkt for å nærme oss dette har vi sammenlignet genuttrykk i ILA-infisert fisk med ulik overlevelse i tid etter smitte. Laks som døde tidlig hadde ikke overraskende høye virusmengder i kroppen og kraftig oppregulering av gener kjent for å være involvert i anti-virale medfødte immunresponser, mange av disse interferon-relaterte. Dødelighetsgruppen i mellomsjiktet hadde tilsvarende høye virusnivåer, men dempede inflammatoriske og cellulære stressresponser, samt oppregulering av gener involvert i adaptiv immunitet og cytotoksisk T-celle respons. Denne vedvarte i laks som overlevde til siste fase av forsøket hvor virusnivået i alle organer var redusert betraktelig. I tillegg viste denne gruppen en oppregulering av immunglobulin-relaterte gener i hjerte.

Disse resultatene antyder at evnen til å kontrollere en tidlig kraftig immunrespons og redusere potensielle skader relatert til overreaktive inflammasjoner (såkalt immunpatologi) kan være viktige faktorer for å motstå høye nivåer av infeksjon over lengre perioder. I tillegg synes en aktivering av humoral og adaptiv T-celle immunrespons viktig for å kvitte seg med virus. Det må bemerkes at responsene som ble observert kan gjenspeile tid etter smitte slik at det ikke kan utelukkes om for eksempel responser tidligere i smittefasen er avgjørende for overlevelse. Dessuten vil selvsagt ulik genetisk bakgrunn kunne påvirke utfallet.

Likevel sier dette oss noe om kausale faktorer som påvirker resistens, og gode korrelater for resistens eller økt toleranse vil også ha stor betydning for evaluering av effekter av andre behandlinger under eksperimentelle betingelser, som for eksempel vaksiner og fórtilsetninger, hvor dødelighet sjelden er god nok måleparameter.

Hvordan beskytter vaksinering mot furunkulose?

Det er utviklet vaksiner mot en rekke laksesykdommer, men mange av disse har varierende effekt og vaksinering betyr sjelden total eliminering av infeksjon. Det er ofte vanskelig å finne gode korrelater mot beskyttelse, spesielt for vaksiner mot virus, som sjelden gir noen sterk antistoffrespons ei heller varig beskyttelse. På dette området er vi overbevist om at en bredspektret analyse av genuttrykk ved microarrays har et stort potensial.

I et nylig avsluttet pilotstudium ønsket vi å lete etter forandringer assosiert med vaksine-indusert beskyttelse mot furunkulose, og analyserte genuttrykk i vev fra vaksinert laks med høy og lav motstandsdyktighet overfor sykdom. Forskjellene mellom resistent og mottakelig fisk var at de fleste immunrelaterte gener var sterkere oppregulert i mottakelig fisk med unntak av et antall gener involvert i komplementsystemet. For den resistente gruppen ble det observert en oppregulering av gener som styrer vedlikehold av ekstracellulær matriks, lipid metabolisme og eliminering av endo- og exogene toksiske substanser i cellene.

Dette betyr at typiske anti-bakterielle responser ikke synes å forbedre motstandsdyktigheten, slik man kanskje ville forventet, mens evnen til å unngå skader forårsaket av både bakterien og akutte immunresponser som følge av infeksjonen har større betydning. Igjen viser dette at sykdomsresponser og resistens/toleranse er meget komplekst og innebærer mer enn bare de klassiske immunresponsene. Basert på overnevnte resultater har vi etablert genmarkører for vaksine-indusert beskyttelse mot furunkulose, som vil kunne anvendes i praktisk uttesting av nye vaksiner.

Fórtilsetninger: immunstimulanter eller -modulanter?

Som en alternativ strategi for å øke motstandsdyktighet overfor sykdom er det knyttet store forventninger til bruken av fórtilsetninger ment å påvirke immunsystemet til fisken. I dag er utviklingen av slike komplisert og med begrenset kunnskap om virkemåte og hvilke målfunksjoner som bør modifiseres i fisken. Vi gjennomførte et pilotforsøk med et beta-glukan fra shiitake sopp kalt lentinan som modell. Regnbueørret som gikk på diett tilsatt lentinan og kontrollfisk ble injisert med bakterielt lipopolysakkarid (LPS) som gir er en velkjent inflammatorisk respons. Microarray analyse viste at lentinan påvirket immunresponser mot LPS på en hemmende snarere enn stimulerende måte.

En gruppe gener involvert i akutte inflammatoriske responser var oppregulert i fisk på kontroll diett. Dette omfattet for eksempel interferon- og tumor nekrose faktor (TNF)- avhengige gener. En tilsvarende trend ble observert for gener involvert i metabolismen av jern- og xenobiotiske stoffer (toksiske fremmedstoffer) og for gener som styrer oksidativt og cellulært stress. En interessant observasjon var at forskjellene mellom lentinan og kontrollfisk overlappet med mange av de samme genprofilene som karakteriserte forskjellene mellom høy- og lavresistent laks mot ILA.

Mer generelt viste de fleste immunrelaterte gener lik regulering mellom lentinan og kontrollfisk, hvilket betyr at lentinan reduserte de akutte reaksjoner utløst av LPS-behandlingen, mens majoriteten av immunresponsene forble uendret sammenlignet med kontrollene. Disse resultatene er i tråd med den generelle oppfatningen at funksjonelle fórtilsetninger bør modifisere heller enn stimulere immunstatus, ved å øke de fordelaktige og redusere de ødeleggende eller destruktive responsene. Anvendelsen av microarrays for å evaluere slike effekter bør ha et stort potensial for utvelgelse av slike immunmodulanter.

Årsakene til laksens sårbarhet overfor lus

Lakselus er et stadig tilbakevendende problem for både vill- og oppdrettslaks. Atlantisk laks er svært mottakelig for denne ektoparasitten sammenlignet med noen beslektede arter, som for eksempel coho laks. Interaksjonen mellom parasitt og vert er meget kompleks, og for å nærme oss en forståelse av dette analyserte vi genuttrykk i hud og indre organer av eksperimentelt infisert laks gjennom lakselusens ulike livsstadier.

Resultatene antydet at laksens dårlige evner til å kvitte seg med parasitten kan skyldes svake inflammatoriske responser indusert i verten. Oppregulering av en rekke immungener viste imidlertid at laksen åpenbart har en rask ‘sensing’av lusa, etterfulgt av en genprofil karakteristisk for hyporesponsive T-celler. Cellulært stress var prevalent i skadet hud, indikert ved oppregulering av gener for heat-shock proteiner, andre chaperoner og mitokondrielle proteiner. Oppregulering av gener involvert i sårheling ble kun observert mot siste stadium av lusens utvikling. Disse resultatene foreslår at en kombinasjon av immunmodulering, kronisk stress og svekket sårheling og reparasjon er faktorer som bidrar til laksens sårbarhet overfor lus.

Felles microarray konsortium

Det er en rivende utvikling på microarray feltet og enhver forsker kan i dag bestille sine egne chips fra kommersielle firmaer. Når det er sagt kreves betydelige ressurser og kompetanse for bearbeiding av data fra slike analyser og det er gjennom et langsiktig og systematisk perspektiv analysene har sin fulle styrke.

Innen forskning på fisk har det vært etablert flere ‘eksklusive’ plattformer basert på cDNA microarrays, men med innføringen av microarrays basert på oligonukleotid sekvenser (korte biter av genene), er tilgjengeligheten og mulighetene for forskere utenfor fagfeltet til stede. Slike oligoarrays har også mange tekniske fordeler; man har tilnærmet ubegrenset tilgang på gener og kan diskriminere mellom beslektede gener eller transkripter fra dupliserte eller multigen-familier, et velkjent fenomen hos mange laksearter. Med dette følger også høyere krav til bioinformatisk support, og en synkronisering og samarbeid på tvers av forskningsgrupper vil gjøre verktøyene og dataene fra slike forsøk langt mer verdifulle.

Vi har derfor de siste fem årene utviklet en omfattende database av alle tilgjengelige gener som er annotert basert på struktur, funksjon og cellulære roller. Databasen er også utviklet for design av microarrays samt prosessering og analysering av data. Men viktigst av alt: alle data fra forsøk lagres i standard format og med kontinuerlig oppdatering av annotering av genfunksjon og genprofiler for ulike egenskaper, noe som muliggjør meta-analyser og utveksling av resultater mellom forskningsgrupper. Databasen ble opprinnelig kalt STARS (Salmon and Trout Annotated Reference Sequences), men inkluderer i tillegg til laks og ørret også sekvenser fra torsk, samt planer om utvidelse til flere arter (zebrafisk, seabass og seabream). STARS brukes i dag av forskningsgrupper både innen Norge og EU, og flere er velkomne til å delta i konsortiet.

Oppsummering

Problemene vi jobber med innen fiskehelse er svært utfordrende, ikke bare fordi sykdom og immunsystemet i seg selv er komplekse prosesser, men også fordi alle ledd i produksjonssyklus, fra fóring til fisketetthet i merdene, påvirker utfallet av sykdom og optimal fiskehelse. I så måte har analysemetoder med høy ‘throughput’ og oppløsning et stort potensial, både for å forstå årsaker til disse problemene samt for å tilby nye verktøy for håndtering av problemene, for eksempel innenfor diagnostikk. Nytteverdien av microarray teknologien har blitt demonstrert både innen human medisin og fiskeforskning, og det er liten tvil om at nye teknologier som ‘proteomics’ og ‘metabolomics’ vil komme i nær framtid.

Et viktig aspekt ved innføringen av ‘omics’, med all informasjonen de genererer, er at de kan bidra til å endre oppfatninger og påvirke gradvise endringer av eksisterende paradigmer. Dette er ikke minst viktig innen forskning på fisk, der vi kan ha en tendens til å adaptere og delvis kopiere etablerte sannheter fra human medisin. Det er for eksempel nærmest en allmenn oppfatning at sykdomsresistens helt eller delvis er en funksjon av immunsystemet. Våre studier viser derimot en negativ korrelasjon mellom overlevelse av fisk og uttrykk av en rekke immungener for en vanlig virussykdom hos laks. Samtidig var resistens assosiert med uttrykk av gener som aldri har vært beskrevet i forbindelse med sykdom.

Konklusjon blir at vi må angripe problemene med kikkert og ikke mikroskop, hvilket betyr at ekspertise innen en metode eller disiplin ikke er tilstrekkelig men at økt tverrfaglig fokus må til om vi skal nærme oss konstruktive løsninger innen fiskehelse.

 Avl og genetikk    Fiskehelse  

Relatert innhold